一种物理性去除卵母细胞透明带的方法与流程

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所属分类:鲷鱼杂谈

一种物理性去除卵母细胞透明带的方法与流程

本发明涉及生物技术领域,具体涉及一种物理性去除卵母细胞透明带的方法。

背景技术:

透明带(zonapellucida,zp)是一层包裹在哺乳动物卵母细胞表层的、主要由卵母细胞分泌形成的细胞外基质,透明带在囊胚形成并长大后破裂,囊胚孵化。透明带在受精中起着至关重要的作用,其结构主要由三种糖蛋白(zp1、zp2、zp3)组成。其中,zp3能识别同物种精子并与之结合,继而诱导精子发生顶体反应,启动受精过程。因此对卵子的发育受精以及着床前胚胎发育起着关键性作用。

随着卵母细胞和胚胎相关应用技术的发展,无透明带卵母细胞在核移植、胚胎发育机制和转基因研究等方面具有较好的应用价值,而传统去除透明带的方法大多是采用酸性台式液或者0.5%链酶蛋白酶消化透明带,但在实际操作中发现此法由于操作不当容易造成卵母细胞丢失,比如嘴吹用力稍大就会使吹出的卵母细胞溶解或者黏在吸管壁上;另外用链酶蛋白酶消化透明带时,严格受时间控制,速度稍微慢点即可使卵母细胞融解于液体中,故一次不能消化太多的卵母细胞,导致效率低。

进而,人们提出了物理性去除透明带方法短鲷卵透明,如申请号为2.8的发明专利申请披露了一种卵母细胞透明带的压电超声切削系统及方法,采用卵母细胞超声切削手术刀从卵母细胞表层的切线方向对透明带进行切削,同时压电超声切削系统设有特制的卵母细胞吸持装置和底部卵母细胞位姿调节芯片,能对卵母细胞起到的辅助支撑作用。该现有技术的操作设备复杂,还需要添加特殊装置和芯片,操作手法不易掌握,成功去除率低,难以保持卵母细胞的活性,且耗时长,去透明带效率低。

因此,有必要探究一种物理性的、对卵母细胞没有损伤的、且效率高、能保持卵母细胞活性的去除卵母细胞透明带的方法。

技术实现要素:

为解决上述问题,本发明提供一种物理性去除卵母细胞透明带的方法,该方法对卵母细胞没有损伤、能保持卵母细胞活性、且能快速有效去除卵母细胞透明带。

本发明通过下列技术方案实现:一种物理性去除卵母细胞透明带的方法,经过下列各步骤:

(1)制备显微操作液微滴:向10mltl-hepes溶液中加入50ul血清白蛋白,再加入50ul双抗,混匀即得到显微操作液;将制备好的显微操作液置于操作盘中,每个操作盘中移入15-20μl的显微操作液,即得到微滴;

(2)将待去除透明带的卵母细胞置于操作盘的显微操作液微滴中,每个微滴一次转入1-20个卵母细胞;

(3)将操作盘置于显微操作仪的显微操作台上,吸取5-10ul无菌生理盐水或者无菌pbs溶液至注射针尖端内腔中,将持卵针和注射针安装在显微操作仪的固定杆上,调节螺旋,在倒置显微镜的视野中观察,使卵母细胞、持卵针和注射针处于同一水平线的位置;

(4)预设显微注射仪在清洗模式下的注射压力pi为120-200hpa、平衡压力pc为220-250hpa,将持卵针与气压式手动显微注射仪连接,通过调节气压式手动显微注射仪旋钮,使卵子固定于持卵针前端,然后将注射针刺入卵母细胞透明带,针尖停留在卵周间隙,此时按清洗按钮,显微注射仪通过注射针泵出的压力使无菌生理盐水或者无菌pbs溶液快速注入到卵母细胞的卵周间隙,致使卵母细胞的胞质从注射针刺穿的透明带孔中跃出,完整的胞质脱去透明带后停留于微滴中,即得到去除透明带的卵母细胞。进而转移至培养液继续培养或者直接用于后续的研究。

所述步骤(1)的微滴上面覆盖一层矿物油。

所述步骤(2)的待去除透明带的卵母细胞包括处于gv期、mⅰ期、mⅱ期或原核期的卵母细胞。

本发明采用常规市购产品显微操作仪完成去除透明带,显微操作仪包括倒置显微镜/体视显微镜、显微操作台和显微注射仪。通常,显微注射仪是用来将供体物(基因、细胞核或细胞其他成分)直接注入宿主细胞(去核卵母细胞、胚胎细胞或体外培养的细胞),而将显微注射仪用于去除卵母细胞透明带的方法还未见报道。常规注入操作中是使用自动键或注射键,而本发明则使用显微注射仪的清洗(clean)键完成,清洗键是当注射针有堵塞情况时,可以长按clean键进行清洗,根据堵塞的严重程度可以调节注射压力的大小,可调压力范围较大,而压力太小,胞质出不来,压力过大,胞质出来会被吹散溶解于液体中,因此,发明人经无数次试验才获得在一定压力范围内完全能实现去除卵母细胞透明带,且成功率和成活率都非常高。

本发明具备的优点及效果:本发明为物理性方法去除卵母细胞透明带,去除效率达99%以上,同时适用于非人灵类动物和啮齿类小鼠的卵母细胞,非常值得推广。

1、操作设备相对简单,不需要添加特殊装置;

2、操作过程简单,掌握简单的显微操作技术人员均可进行;不会产生粘在皿底的现象;

3、能较好保持卵母细胞活性,不需要把卵母细胞转移到特别的容器或者其它液体中,仍在日常的卵母细胞培养皿和卵母细胞的体外操作液中完成,卵母细胞本来就是相当脆弱和敏感的,本发明有利于卵母细胞在体外保持活性;

4、去透明带快,效率高,平均每个卵母细胞去透明带时间1秒(800毫秒-1000毫秒),可以在短时间内完成多个去除卵母细胞透明带的操作;

5、去透明带比率高,可达99.9%的成功率;

6、去透明带后完整光滑,无损伤,机械损伤小,在显微操作仪下即可完成多个卵母细胞去透明带的操作,避免了使用台式液在操作稍有疏忽时即可使卵母细胞溶解或者丢失的的难点;

7、属于物理性方法去除透明带,避免了酶对卵母细胞的影响,可适用于各类动物的卵母细胞,进一步地,也适用于实验室进行无透明带的单细胞rna提取研究及其胚胎发育相关的早期事件研究。

总之,本发明在显微操作仪下即可完成去透明带操作,随着对各生命科学研究领域对卵母细胞和胚胎的研究工作越来越多,卵母细胞及胚胎的去透明带操作越是要求越来越高,本发明便于迅速推广应用。

附图说明

图1为实施例1操作仪器的结构示意图;图中,1.卵母细胞;2.持卵针;3.注射针;4和5为持针器;6.celltramair气压式手动显微注射仪;7.celltramair气压式手动显微注射仪末端旋钮;8.eppendorffemtojet显微注射仪;9.eppendorffemtojet显微注射仪调节注射压力(pi)的旋钮;10.eppendorffemtojet显微注射仪调节时间(time)的旋钮;11.eppendorffemtojet显微注射仪调节平衡压力(pc)的旋钮。

图2为实施例1的食蟹猴卵母细胞去除透明带后的显微镜像图;

图3为实施例2的c57小鼠卵母细胞去除透明带后的显微镜像图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细说明,但本发明保护范围不局限于所述内容,实施例中使用的试剂和方法,如无特殊说明,均采用常规试剂和常规方法。

实施例1

主要仪器设备:显微注射仪(德国eppendorf,femtojet4i);nikon体视显微镜(日本);气压式手动显微注射仪(品牌:eppendorf,型号:celltramair,产地:germany);注射针(mic-35-35,origio,美国);持卵针(mph-med-35,origio,美国);培养皿、巴斯德吸管购自美国falcon公司;移液管购自德国eppendorf公司。

按常规促排卵的方法采集雌性食蟹猴的卵母细胞,对食蟹猴卵母细胞经物理性方法去除透明带,具体步骤如下:

(1)制备显微操作液微滴:向10mltl-hepes溶液(caisson,usa)中加入50ul血清白蛋白(bsa,sigma,usa),再加入50ul双抗(gibco,usa),混匀即得到显微操作液;将制备好的显微操作液置于操作盘中,在规格为35mm的塑料皿操作盘中,将皿均等划分为5个区域(中间一个区域,上下左右各一个区域,呈十字形状),在每个区域内的皿中用移液枪移入各15-20μl的显微操作液,最中心一个称中心微滴,去透明带的操作主要在这个微滴中完成,外围微滴主要用于洗卵母细胞,中心微滴上面覆盖一层矿物油;

(2)卵母细胞置于微滴中:将待去除透明带的卵母细胞(包括gv期、mⅰ期、mⅱ期及原核期)置于步骤(1)的外围微滴中,在体视显微镜下用吸卵针洗涤5次,再放入覆盖有矿物油的中心微滴,每个中心微滴一次转入1-20个卵母细胞;

(3)将操作盘置于显微操作仪的显微操作台上,用移液枪吸取5-10ul无菌生理盐水至注射针尖端内腔中,将持卵针和注射针安装在显微操作仪的固定杆上,调节螺旋,在倒置显微镜的视野中观察,使卵母细胞、持卵针和注射针处于同一水平线的位置,如图1所示;

(4)预设显微注射仪在清洗模式下的注射压力pi为150hpa、平衡压力pc为230hpa,将持卵针与气压式手动显微注射仪连接,通过调节气压式手动显微注射仪旋钮,使卵子固定于持卵针前端,然后将注射针轻轻刺入卵母细胞透明带,针尖停留在卵周间隙,此时按清洗(clean)按钮800毫秒短鲷卵透明,瞬间,显微注射仪通过注射针泵出的压力使无菌生理盐水快速注入到卵母细胞的卵周间隙,由于无菌生理盐水迅速占用胞质空间,巨大的压力致使卵母细胞的胞质瞬间从注射针刺穿的透明带孔中一跃而出,完整的胞质脱去透明带后停留于微滴中,即得到去除透明带的卵母细胞。

之后继续固定另外一个卵母细胞,按同样方法去除其透明带。所有卵母细胞操作完毕,用吸卵针将卵母细胞转移到外围微滴中洗3遍即可,之后转移至培养液继续培养或者直接用于后续的研究。

本例的去除率达100%,细胞死亡率0.1%。

实施例2

按常规促排卵的方法采集雌性c57小鼠的卵母细胞,对c57小鼠卵母细胞经物理性方法去除透明带,具体步骤如下:

(1)同实施例1;

(2)同实施例1;

(3)将操作盘置于显微操作仪的显微操作台上,用移液枪吸取5-10ul无菌pbs溶液至注射针尖端内腔中,将持卵针和注射针安装在显微操作仪的固定杆上,调节螺旋,在倒置显微镜的视野中观察,使卵母细胞、持卵针和注射针处于同一水平线的位置;

(4)预设显微注射仪在清洗模式下的注射压力pi为120hpa、平衡压力pc为220hpa,将持卵针与气压式手动显微注射仪连接,通过调节气压式手动显微注射仪旋钮,使卵子固定于持卵针前端,然后将注射针轻轻刺入卵母细胞透明带,针尖停留在卵周间隙,此时按清洗(clean)按钮1秒,瞬间,显微注射仪通过注射针泵出的压力使无菌pbs溶液快速注入到卵母细胞的卵周间隙,由于无菌pbs溶液迅速占用胞质空间,巨大的压力致使卵母细胞的胞质瞬间从注射针刺穿的透明带孔中一跃而出,完整的胞质脱去透明带后停留于微滴中,即得到去除透明带的卵母细胞。

之后继续固定另外一个卵母细胞,按同样方法去除其透明带。所有卵母细胞操作完毕,用吸卵针将卵母细胞转移到外围微滴中洗3遍即可,之后转移至培养液继续培养或者直接用于后续的研究。

本例的去除率为98.5%,细胞死亡率0%。

替换步骤(4)中的注射压力pi、平衡压力pc及时间,得到下表的结果:

实施例3

按常规促排卵的方法采集雌性水牛的卵母细胞,对水牛卵母细胞经物理性方法去除透明带,具体步骤如下:

(1)同实施例1;

(2)同实施例1;

(3)将操作盘置于显微操作仪的显微操作台上,用移液枪吸取5-10ul无菌pbs溶液至注射针尖端内腔中,将持卵针和注射针安装在显微操作仪的固定杆上,调节螺旋,在倒置显微镜的视野中观察,使卵母细胞、持卵针和注射针处于同一水平线的位置;

(4)预设显微注射仪在清洗模式下的注射压力pi为200hpa、平衡压力pc为250hpa,将持卵针与气压式手动显微注射仪连接,通过调节气压式手动显微注射仪旋钮,使卵子固定于持卵针前端,然后将注射针轻轻刺入卵母细胞透明带,针尖停留在卵周间隙,此时按清洗(clean)按钮1秒,瞬间,显微注射仪通过注射针泵出的压力使无菌pbs溶液快速注入到卵母细胞的卵周间隙,由于无菌pbs溶液迅速占用胞质空间,巨大的压力致使卵母细胞的胞质瞬间从注射针刺穿的透明带孔中一跃而出,完整的胞质脱去透明带后停留于微滴中,即得到去除透明带的卵母细胞。

之后继续固定另外一个卵母细胞,按同样方法去除其透明带。所有卵母细胞操作完毕,用吸卵针将卵母细胞转移到外围微滴中洗3遍即可,之后转移至培养液继续培养或者直接用于后续的研究。

本例的去除率为99.9%,细胞死亡率0%。

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